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科研进展

聚焦离子束法制备冷冻含水切片

发布者:中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台 时间:2016年09月07日
聚焦离子束法制备冷冻含水切片
(张建国、季刚、黄小俊、李硕果、孙飞、徐伟) 

低温电子断层成像三维重构(cryo-ET)技术是发展结构生物学和细胞生物学重要的研究手段。该技术可以得到更真实的接近天然状态的细胞内部高分辨率的三维结构以及蛋白质大分子定位及相互作用的信息,是蛋白质组学研究的重要辅助手段被成为“可视化蛋白质组学”(Visual Approach to Proteomic)。常用的样品制备方法–含水冷冻超薄切片技术,存在严重的压缩、振颤、皱缩、断裂以及载网附着能力差等,以及技术难度大,成功率低等问题。人们期望寻找到更理想的样品制备方法。2006年M.Marko等人发现聚焦离子束方法加工的冷冻至玻璃态的生物样品并未出现重结晶现象,由此开启了利用聚焦离子束技术制备生物样品含水冷冻超薄切片方法的探索。 

该技术首先需要将细胞样品滴到载网上,经过快速投掷液氮冷却的乙烷中制得玻璃态的冷冻含水样品,然后将样品转移到液氮温度的自制的样品座上,并一起转移进双束扫描电镜样品室低温样品台中,进行FIB减薄操作。制备出的200nm厚的样品转移到低温透射电镜中进行数据成像和收集。图1显示了我们利用聚焦离子束法制备的冷冻含水切片的过程和冷冻含水切片样品的透射电镜照片,可见细胞内部的亚细胞结构,和一些大分子复合物的结构。 

实验结果表明,聚焦离子束是可以用以制备生物样品的含水冷冻超薄切片的。然而,要作为一种成熟的技术应用于低温电镜生物样品制备,还有很长的路要走,许多困难与技术难题需要深入探索与克服。 


聚焦离子束法制备冷冻含水切片


1.聚焦离子束法制备冷冻含水切片,(A)为载网支持膜上冷冻的细胞,(B)为粗切细胞剩余较厚的切片,(C)精细切割后较薄的切片。(D)低倍下投射电镜观察整个切片的结构(E)中等倍数小观察切片中细胞结构的信息,(F)高倍观察(E)中方框区域的结构(FIMOD处理电子断层成像数据后SF9细胞线粒体,微管(箭头)和内部大分子复合物。


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